Il Cenacolo fu probabilmente iniziato nel 1494 e in mancanza di documenti (gli archivi del convento sono andati distrutti) si è portati a considerare che nel 1497 l'opera era quasi terminata. Infatti Luca Pacioli, nella lettera dedicatoria della sua "Divina Proportione" in data 9 febbraio 1498, informa che il Cenacolo è finito e che costituisce una delle massime espressioni artistiche di Milano.

Ben presto però, a venti anni circa dall'ultimazione, il dipinto comincia a mostrare segni evidenti di degrado legati in parte alla tecnica adottata da Leonardo: la tempera, se da un lato gli aveva permesso di lavorare con la massima libertà, dall'altro risultava un materiale molto fragile in presenza di umidità.

Le testimonianze sul degrado del celebre dipinto iniziano nel 1517 con Antonio De Beatis e si susseguono ininterrotte fino all'intervento del pittore Michelangelo Bellotti nel 1726 con cui ha inizio una lunga serie di restauri o meglio dei tentativi di porre rimedio ai problemi della celebre opera. Interventi di consolidamento furono quelli di Luigi Cavenaghi eseguiti nel 1901 e nel 1908 e di Oreste Silvestri, nel 1924, che fissa tutti i bordi pericolanti con stucchi nerastri. Tra il 1951 e il 1954 il dipinto viene restaurato da Mauro Pelliccioli che consolida ancora una volta la superficie e ripristina la cromia senza però rimuovere le antiche ridipinture.

Il degrado però non si arresta, anzi inquinamento e smog provocano l'annerimento della pittura. Dal 1978 al 1999 viene eseguito da Pinin Brambilla Barcilon il lungo e delicato restauro.